mRNA药物制备的关键技术——切向流过滤的高效应用
时间：2024.07.15
mRNA药物作为一种新型的生物制药技术，因其在治疗和预防疾病方面的潜力而受到广泛关注。切向流过滤（TFF）技术高效率、高回收率特点，在mRNA药物制备中作用很大。
一、什么是mRNA？
mRNA是细胞中的一种核糖核酸，它携带遗传信息，指导细胞制造特定的蛋白质。在mRNA药物中，人工合成的mRNA被设计用来编码治疗性蛋白质，这些蛋白质可以用于治疗或预防疾病。
二、mRNA药物工作原理
编码设计：科学家设计并合成一段特定的mRNA序列，这段序列编码了一种治疗性的蛋白质。
传递进入细胞：为了确保mRNA药物有效进入患者细胞内，需要一种有效的传递系统如脂质纳米颗粒（LNP），对其进行包裹保护，防止mRNA在到达作用部位前被酶解或无法穿透细胞膜。
蛋白质合成：一旦mRNA进入细胞，它就会被细胞的蛋白质合成机制识别，并指导细胞合成所需的治疗性蛋白质。
传递进入细胞：为了确保mRNA药物有效进入患者细胞内，需要一种有效的传递系统如脂质纳米颗粒（LNP），对其进行包裹保护，防止mRNA在到达作用部位前被酶解或无法穿透细胞膜。
蛋白质合成：一旦mRNA进入细胞，它就会被细胞的蛋白质合成机制识别，并指导细胞合成所需的治疗性蛋白质。
三、TFF技术在mRNA药物制备中的应用
1、mRNA生产工艺步骤
mRNA的生产工艺步骤基本上分为以上三个步骤，质粒DNA原液制备的基础是转录模板的序列设计，制备方法通常采用质粒DNA扩增，也可采用PCR扩增。以DNA扩增为例，通常采用工程菌E.coli发酵来扩增。先进行菌种复苏，质粒DNA的生产经过发酵培养、收获澄清、精制纯化、线性化、分装储存等步骤。mRNA原液制备主要工艺包括将线性化质粒DNA体外转录（IVT）为mRNA，进行化学修饰后分离纯化，纯化后的mRNA原液分装冻存。mRNA制剂的主要工艺包括mRNA-LNP包封制备、纯化、除菌过滤、无菌灌装等。我们本文将重点讨论哪些步骤需要用到TFF工艺，如何选择膜包和中空纤维，具体用到哪些规格等。
2、质粒DNA原液制备
上游质粒扩增的主要工艺是通过E.coli发酵，培养结束后，需要对菌体进行收集。实验室离心机受限于其操作，难以满足商业化规模化生产，工业上连续流离心机剪切力较高。而中空纤维有开放式的通道，能够处理高固含量、高粘度、剪切敏感的样品，并且具有良好的放大能力。收集采用750kD/100nm的中空纤维膜柱，去除细胞碎片及培养基组分。接下来采用高压均质机破碎、超声裂解、碱裂解进行菌体裂解，通过深层过滤进行澄清。为便于层析纯化，在层析上样前，先采用TFF进行浓缩和换液，以大大减少样品体积，同时去除部分RNA、HCP、HCD等杂质。
依据质粒DNA分子量大小选用30kD/100kD/300kD，TMP小于0.5bar。然后，通过层析进行精制纯化。经过层析后质粒DNA的纯度已经很高，根据线性化步骤的需要，可以先进行超滤浓缩换液，依据质粒DNA分子量大小选用30kD/100kD/300kD，再采用限制性内切酶完成质粒DNA的线性化。完成线性化后，采用除菌过滤来控制微生物负荷。
由于质粒DNA为胞内产物，并且生产特定长度和序列的mRNA需要高度纯化且线性化的质粒原料，整个下游纯化过程工艺路线较为复杂，收率不高（30%~40%），这造成行业的质粒生产成本较高，如何优化和改良下游纯化工艺，成为目前质粒DNA制备环节中急需解决的问题。
mRNA的生产工艺步骤基本上分为以上三个步骤，质粒DNA原液制备的基础是转录模板的序列设计，制备方法通常采用质粒DNA扩增，也可采用PCR扩增。以DNA扩增为例，通常采用工程菌E.coli发酵来扩增。先进行菌种复苏，质粒DNA的生产经过发酵培养、收获澄清、精制纯化、线性化、分装储存等步骤。mRNA原液制备主要工艺包括将线性化质粒DNA体外转录（IVT）为mRNA，进行化学修饰后分离纯化，纯化后的mRNA原液分装冻存。mRNA制剂的主要工艺包括mRNA-LNP包封制备、纯化、除菌过滤、无菌灌装等。我们本文将重点讨论哪些步骤需要用到TFF工艺，如何选择膜包和中空纤维，具体用到哪些规格等。
2、质粒DNA原液制备
上游质粒扩增的主要工艺是通过E.coli发酵，培养结束后，需要对菌体进行收集。实验室离心机受限于其操作，难以满足商业化规模化生产，工业上连续流离心机剪切力较高。而中空纤维有开放式的通道，能够处理高固含量、高粘度、剪切敏感的样品，并且具有良好的放大能力。收集采用750kD/100nm的中空纤维膜柱，去除细胞碎片及培养基组分。接下来采用高压均质机破碎、超声裂解、碱裂解进行菌体裂解，通过深层过滤进行澄清。为便于层析纯化，在层析上样前，先采用TFF进行浓缩和换液，以大大减少样品体积，同时去除部分RNA、HCP、HCD等杂质。
依据质粒DNA分子量大小选用30kD/100kD/300kD，TMP小于0.5bar。然后，通过层析进行精制纯化。经过层析后质粒DNA的纯度已经很高，根据线性化步骤的需要，可以先进行超滤浓缩换液，依据质粒DNA分子量大小选用30kD/100kD/300kD，再采用限制性内切酶完成质粒DNA的线性化。完成线性化后，采用除菌过滤来控制微生物负荷。
由于质粒DNA为胞内产物，并且生产特定长度和序列的mRNA需要高度纯化且线性化的质粒原料，整个下游纯化过程工艺路线较为复杂，收率不高（30%~40%），这造成行业的质粒生产成本较高，如何优化和改良下游纯化工艺，成为目前质粒DNA制备环节中急需解决的问题。
3、mRNA原液制备
体外转录（IVT）和修饰是mRNA原液制备的关键工艺，涉及多个步骤，包括转录、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等步骤，转录和修饰后，可采用30kD/100kD/300kD的膜包和中空纤维膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制剂等杂质，并置换buffer。然后采用亲和层析、尺寸排阻层析、离子对反相层析、离子交换层析等层析工艺进行精制纯化，经过前述超滤、层析等纯化步骤后，mRNA已经达到相当的纯度，再使用30kD/100kD/300kD膜包或中空纤维膜柱调整原液中mRNA浓度并置换buffer。采用除菌过滤来控制微生物负荷进行暂存封装。
体外转录（IVT）和修饰是mRNA原液制备的关键工艺，涉及多个步骤，包括转录、5’端加帽、3’端加Poly(A)尾、去磷酸化等步骤，转录和修饰后，可采用30kD/100kD/300kD的膜包和中空纤维膜柱去除RNA聚合酶、DNA片段、NTPs、加帽酶、dsRNA、抑制剂等杂质，并置换buffer。然后采用亲和层析、尺寸排阻层析、离子对反相层析、离子交换层析等层析工艺进行精制纯化，经过前述超滤、层析等纯化步骤后，mRNA已经达到相当的纯度，再使用30kD/100kD/300kD膜包或中空纤维膜柱调整原液中mRNA浓度并置换buffer。采用除菌过滤来控制微生物负荷进行暂存封装。
4、mRNA制剂制备
mRNA-LNP包封制备是mRNA制剂制备的关键工艺，除了脂质成分配方外，就是工艺过程的控制了，即如何控制mRNA与脂质成分的接触和相互作用过程，通过微流控技术以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物。mRNA-LNP溶液通过100kD/300kD TFF技术进行浓缩换液，mRNA-LNP复合物被截留，乙醇、制剂被洗滤。最后除菌过滤采用0.22μm除菌级过滤器冗余设置，截留细菌等微生物污染物。最终，进行无菌灌装。
mRNA-LNP包封制备是mRNA制剂制备的关键工艺，除了脂质成分配方外，就是工艺过程的控制了，即如何控制mRNA与脂质成分的接触和相互作用过程，通过微流控技术以形成稳定、均一、收率高的mRNA-LNP复合物。mRNA-LNP溶液通过100kD/300kD TFF技术进行浓缩换液，mRNA-LNP复合物被截留，乙醇、制剂被洗滤。最后除菌过滤采用0.22μm除菌级过滤器冗余设置，截留细菌等微生物污染物。最终，进行无菌灌装。
在mRNA技术在传染病疫苗领域获得突破性进展的同时，mRNA技术在其它领域的应用也正在展开。我们期待随着科学的进步和技术的发展，mRNA技术能够获得更为广泛的应用，造福广大病患！